martedì 27 novembre 2012

Clonare un fungo con il bisturi

Abbiamo già visto come clonare un fungo con la siringa: si tratta dell'unica tecnica di clonazione che ci permette di creare una LC pulita senza glove-box; tuttavia, è piuttosto difficile da attuare (specie con funghi dalla carne elastica come il Pleurotus ostreatus), e spesso non dà i risultati sperati. Adesso che però abbiamo costruito una glove-box, possiamo utilizzare un altro sistema, decisamente più semplice. Il meccanismo è analogo a quello che già conosciamo: si tratta semplicemente di riuscire ad inserire un frammento di tessuto dentro al barattolo di acqua e miele sterilizzati. Invece della siringa però useremo un bisturi per ritagliare il pezzetto di fungo, e lo inseriremo nel barattolo semplicemente aprendo il coperchio. Lavorando in glove-box è infatti possibile evitare che eventuali contaminanti entrino nel barattolo al momento dell'apertura. Il tessuto dovrà essere prelevato dalla parte interna del fungo, dopo averlo rotto a metà (senza tagliarlo). Ho girato un video per facilitare la comprensione di questa tecnica. L'attrezzatura necessaria è composta da un fungo da clonare (nel mio caso Pleurotus ostreatus), due bisturi avvolti in carta stagnola e sterilizzati per 15 minuti in pentola a pressione, ed un barattolo di acqua e miele al 4%, preparando secondo l'apposita guida.
La prima cosa da fare, è pulire accuratamente la glove-box con alcool, compresi gli angoli, il coperchio e le maniche. Le pareti e la base devono essere lasciati leggermente umidi, così da impedire che spore indesiderate possano muoversi liberamente. Fatto questo, mettiamo dentro la nostra attrezzatura, chiudiamo il coperchio ed aspettiamo 15 minuti, per sicurezza. Una volta trascorsi, possiamo iniziare: indossiamo un paio di guanti di lattice, laviamoli bene con alcool, e mettiamo le mani dentro alla nostra glove-box. Scartiamo il primo bisturi, ed incidiamo leggermente il fungo, ma senza andare a fondo (la lama non deve toccare la parte centrale): poi lo spezziamo con le mani, stando sempre bene attenti a non toccare la parte interna. Scartiamo l'altro bisturi, preleviamo un frammento dalla parte centrale del fungo e lo mettiamo dentro al barattolo, aprendo il coperchio. Come potete vedere, è molto più semplice della clonazione con siringa.
Una volta completata l'operazione, mantenete il barattolo al buio ad una temperatura di 20-25°. Se tutto va bene, la crescita dovrebbe risultare visibile entro una settimana. Se il liquido diventa lattiginoso, buttate via e ricominciate da capo.
Buon divertimento ;)



P.S. Per ovvie ragioni ho ripreso il tutto senza mettere il coperchio, ma voi ovviamente lo dovrete mettere ;)

29 commenti:

  1. avevo intuito che si potesse fare, ma un mese fà, prima di cominciare a seguirti l'ho fatto uguale, ma senza glove box :-(
    risultato....tanto miele caramellato con acqua limpida e micelio inesistente.

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  2. Sara per la prossima dai Beppe ma stavolta ����������

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  3. Riprova con questo metodo, ed avrai più fortuna :)

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  4. ho fatto la glove box.....è bellissima solo che non è trasparente come la tua ex.... comunque userò il coperchio che è arancione come piano d'appoggio........AL CONTRARIO DI TESTA IN GIU' mi sebra comoda nei movimenti

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  5. ma se devo fare più barattoli devo usare 2 bisturi a barattolo????

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  6. Il fatto di usare 2 bisturi è una misura precauzionale che prendevo io, perché con il primo incidi solamente il fungo, senza andare a fondo, in modo che sia facile spezzarlo bene con le mani. Con il secondo prelevi il tessuto, tagliandolo dalla parte di fungo dove non è arrivato il primo bisturi. Quindi ti serve solo un bisturi per prelevare il tessuto, a prescindere da quanti barattoli vuoi inoculare. Per pulire il bisturi tra un trasferimento e l'altro puoi prendere un bicchierino da grappa, riempito d'alcool e metterlo dentro la glove box. Tra un trasferimento e l'altro, basterà tenere immersa la lama nel bicchierino per uno- due minuti per essere quantomeno sicuri di ridurre eventuali rischi.

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  7. ho fatto proprio così senza saperlo, sono un bravo allievo (modesto)....vediamo che ne viene fuori

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    1. viene fuori un ca..o!!!!!!
      purtroppo con la siringa ho 3 successi su 18 vasetti..
      sei vasetti a bisturi in glove box, un paio con un pò di micelio che si è arrestato nella crescita (contaminato forse???).
      Una porzione troppo grossa di fungo può causare insuccesso??
      Quali sono gli errori più grossolani che potrei aver commesso??
      :-(((( molto deluso da questo esperimento :-((((

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  8. Sei sicuro di aver lavorato con strumenti sterilizzati a dovere? Un frammento di fungo grande non causa insuccessi, ma ti consiglio di metterne uno abbastanza piccolo, per ridurre le possibilità di contaminazione. È probabile che tu abbia inavvertitamente toccato la parte interna del fungo, che si è contaminata. A quale temperatura conservi i barattoli?

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  9. potrei aver fatto toccare la porzione tagliata all'interno con la parte esterna del gambo, causa la difficoltà a muovere le braccia nella glove box!!!
    Anche la temperatura sarà di circa 18 max 20 ° :-)
    Se la causa è la temperatura basta attendere un pò di più?

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  10. Salve a tutti,

    i bisturi devo sterilizzarli in pentola a pressione oppure basta disinfettarli con alcool?
    Oggi ho costruito la glove box domani provo a clonare un cardoncello.
    Ringrazio anticipatamente.

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  11. meglio sterilizzarli in pentola a pressione, e tenerli immersi qualche minuto in alcool prima di eventuali utilizzi successivi ;)

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  12. oggi ci ho riprovato, ma ho tanti dubbi, mi muovo troppo in glove box e forse maneggio più di un fungo buttando spore e batteri a dx e a manca............bhooo vediamo

    P.S. i bisturi erano usa e getta è li ho squagliati in pentola a pressione.

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  13. Penso di poter escludere il cattivo funzionamento della glove box (penso!!!!) perchè ho fatto dal 06 dic ad oggi altri due tentativi di tre barattoli (sei in tutto in due tentativi) TUTTI FALLITI CON OSTREATUS............Ma la seconda volta avevo il master della mia prima LC ridotto a pochi ml. ed ho fatto una follia in glove box: ho preparato un vasetto come per le LC (insieme ai tre del secondo fallimento) ed ho travasato il master nella sostanza "fresca di preparazione" sembra perfetto!!

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  14. Cioè hai versato letteralmente la LC da un barattolo all'altro? Una volta così ho inoculato un barattolo di segatura ed ha funzionato, ma sinceramente non mi sento di consigliarlo!

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  15. si era un gesto folle perchè ormai il master era pieno di silicone e ne era rimasto meno di un cm. sul fondo. Quindi ago tappato ad ogni aspirazione.

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  16. Strano che tu abbia avuto problemi sol silicone. Fossi in te cambierei marca. Il gesto folle comunque potrebbe funzionare :)

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  17. http://imageshack.us/photo/my-images/145/20121223130638.jpg/

    ci siamo anche con il bisturi, si vede ben poco ma c'è traccia di micelio :-)

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  18. Bene, vedo che stai progredendo in fretta :)

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  19. Da un buon maestro...un discreto allievo :-)))

    Ultimi sei barattoli di LC(tanti ne vanno nella mia pentola), tutti e sei partiti :-), ma c'è un però.... a sei gg. due già hanno un colorito opacizzato nonostante il micelio già in discreta crescita...... buttare???? o testare???

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  20. Prima di buttare c'è sempre tempo :) aspetta e vedi se il liquido diventa cristallino. Poi se sei indeciso testa, e vedi cosa viene fuori

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  21. avevo già buttato :-(((((
    quindi finchè c'è micelio c'è speranza???? può diventare limpida dopo?

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  22. Dipende, se l'intorpidimento è chiaramente dovuto ai batteri, direi di no. Se invece era dovuto ai residui sul fondo del barattolo, a volte il micelio riesce a mangiarseli ed a crescere. Comunque sì, finché c'è micelio c'è speranza, bisogna buttare via solo quando la situazione è irrimediabilmente compromessa

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  23. io non penso di riuscire a capire la causa di un intorbidimento!!!! forse capirò col tempo, per ora mi sembra sempre batterico.

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  24. a me è successa una cosa strana. il fungo si è spezzettato (era di consistenza plastica e fibrosa il fungo) ma non si è visto la benchè minima traccia di micelio. Possibile? niente batteri o altro visibili

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  25. Ciao, dovresti essere più specifico se possibile. Non sono riuscito a capire la domanda.

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  26. Ciao! Hai mai provato a clonare una Clitocybe Geotropa? E' tecnicamente possibile?
    Non l'ho mai vista in vendita nonostante il pregio delle sue carni..

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  27. Ho provato, la clonazione è molto difficile ma sicuramente non impossibile. Il micelio non si sviluppa sul substrato artificiale, ma solo sul frammento di fungo. Alcune specie di Clitocybe sono coltivate in Cina, per cui non credo si tratti di un'impresa impossibile. A quanto so però il geotropa non è al momento coltivato da nessuno.

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  28. Sto cercando di clonare il pioppini e sta diventando un ossessione perché ho provato in ogni modo con siringa e anche col bisturi in glove box non capisco cosa sbaglio visto che ho già clonato pleurotus con successo in glove box secondo te cosa può essere ti ringrazio anticipatamente

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