domenica 3 febbraio 2013

Utilizzare agar e petri

Uno dei diversi usi cui le capsule di petri si prestano bene è quello della clonazione di un fungo. Avendo la possibilità di controllare le contaminazioni infatti, è possibile ricavare una coltura di micelio con maggior facilità rispetto che con la LC. Gli organismi competitori (muffe e batteri) saranno ben visibili nella piastra, e sarà quindi possibile salvare il micelio, semplicemente prelevandone un frammento con un bisturi sterile. Ovviamente le condizioni di lavoro dovranno essere le solite: glove-box o, meglio, cappa a flusso laminare, rispettando tutte le precauzioni necessarie.
Per clonare un fungo con le piastre di petri, il fondamento è lo stesso che nella LC: si tratta di prelevare un frammento o più dalla parte interna del fungo, e depositarla sull'agar. Nel giro di qualche giorno il micelio inizierà a crescere dal frammento, e passerà ad aggredire l'agar. Il passo successivo sarà procedere a prelevare un piccolo frammento di micelio, e depositarlo in un'altra piastra, così da ottenere una coltura pulita al 100%. Potremo poi usare il petri per inoculare i barattoli di spawn, semplicemente prelevando un triangolino di agar colonizzato e depositandolo nel barattolo, aprendolo e richiudendolo velocemente (ovviamente sempre in glove-box o davanti alla cappa a flusso laminare).

Ho realizzato un video che mostra come lavorare. Per prima cosa ricordatevi di lavarvi accuratamente le mani, preferibilmente con sapone antibatterico, o meglio ancora usare i guanti di lattice, disinfettandoli poi con alcool. Poiché il tessuto va prelevato dalla parte interna del fungo, dovrete prima romperlo a metà, senza tagliarlo, così che la parte centrìale del fungo non venga a contatto con la lama del bisturi, che potrebbe trasportare eventuali contaminanti presenti sulla parte esterna del fungo. Se lavorate con funghi dalla consistenza particolarmente elastica o dura, che non è possibile spezzare con facilità (ad esempio un Pleurotus ostreatus adulto) potete incidere leggermente solo lo strato superficiale del fungo con il bisturi, per poi spezzarlo con le mani e prelevare il frammento dalla parte centrale, che non è stata toccata dalla lama. Nel video che segue, ho appunto fatto così. Se lavorate di fronte ad una cappa a flusso laminare fate attenzione a non frapporre la mano tra il filtro ed il fungo, perché potreste provocare contaminazioni. Per aumentare le probabilità di riuscita, è buona cosa depositare più frammenti di tessuto in ogni piastra; se compaiono batteri o muffe, trasferite immediatamente un piccolo triangolino di micelio su di un'altra piastra, ed aspettate che il micelio si riprenda e ricominci la crescita (con le specie più aggressive già al secondo giorno). Questo metodo è utilizzabile anche per moltiplicare le colture; da un singolo petri se ne possono ricavare decine e decine; di questo però parlerò in un post successivo.
Dopo l'inoculazione, le piastre devono essere sigillate. Il miglior metodo per farlo è utilizzare il Parafilm.



Si tratta di una pellicola appositamente studiata per questo tipo di utilizzo: elastica, impermeabile e che allo stesso tempo favorisce o scambio gassoso. Potete trovarla negli ingrossi di microbiologia; è piuttosto costosa ma un rotolo vi basterà per migliaia di petri. Se non avete la possibilità di trovarla, potete usare la solita pellicola che abbiamo già utilizzato per sigillare i petri in fase di preparazione.

Di seguito il video:

 


Una volta che il petri è inoculato e sigillato, non resta che aspettare. Temperature intorno ai 20°-22° favoriscono la crescita, ma non vi consiglio di mettere i petri in un incubatore, perché gli sbalzi di temperatura favoriscono la formazione di condensa; si rischia di ritrovarsi con lo strato di agar rinsecchito ed il petri pieno d'acqua.
Nel giro di qualche giorno qualcosa inizierà sicuramente a crescere. Se avrete lavorato bene, con buona probabilità il micelio risulterà visibile nel giro di qualche giorno. Se notate la comparsa di muffe o batteri contemporaneamente a quella del micelio, trasferite al più presto un triangolino di agar colonizzato su una piastra pulita, ed aspettate che ricresca. Se invece notate la crescita di solo micelio, potete anche trasferire dopo qualche giorno ancora.


Dopo qualche giorno dal trasferimento su di una piastra pulita (in questo caso 7 giorni) la crescita riprende ed aggredisce rapidamente l'agar della piastra. Una volta che la crescita è completa, la piastra è pronta da utilizzare.



Esistono innumerevoli tipi di organismi che possono proliferare sull'agar: se volete approfondire l'argomento, potete andare a ripassare un po' di biologia :) Qui però ci occupiamo di coltivazione di funghi commestibili, e quindi possiamo anche parlare in modo molto più generico. I 3 contaminanti più frequenti sono muffe, lieviti e batteri. I primi due appartengono al regno dei funghi, mentre i batteri appartengono ad uno autonomo. Le muffe si presentano come chiazze pelose dal colore e variabile (nero, verde, giallo, rosa, ecc.), anche se il loro colore iniziale è spesso bianco, cosa che può far cadere in errore, facendo credere che si tratti di micelio. La parte colorata della muffa è costituita da spore, che si possono facilmente spargere su tutta la piastra. La crescita delle muffe è spesso molto più rapida di quella del micelio, per cui se notate cambiamenti di colore sospetti preoccupatevi di trasferire il prima possibile il micelio vero in una piastra pulita.
I batteri invece si presentano come chiazze informi dall'aspetto lucido, simili a muco e dalla crescita rapidissima, spesso in grado di invadere un'intera piastra nel giro di uno o due giorni. 
In questa immagine sono visibili (in senso orario) una chiazza di micelio, una di batteri, ed una di muffa.


In questa invece si nota una chiazza di batteri che ha circondato un pezzetto di fungo pioppino (Agrocybe cylindracea). Ciò nonostante, il micelio è riuscito a superare la chiazza e bloccarne lo sviluppo, successivamente si sono addirittura formati minuscoli primordi sul frammento di tessuto! In questo caso per operare un trasferimento il micelio andrebbe prelevato da una zona incontaminata, come ad esempio quella indicata dalla freccia rossa.


I lieviti hanno invece una crescita più lenta, e crescono in chiazze dall'aspetto opaco. 


(L'immagine non è mia, l'ho presa da qui, poiché non ne avevo una disponibile, appena ho l'occasione la sostituirò.)
Spesso il micelio delle specie più aggressive aggira completamente le chiazze di lievito, bloccandone lo sviluppo, oppure le ingloba direttamente. In questa foto si notano alcune chiazze di lieviti al centro della piasstra, che sono sono state completamente inglobate dal micelio, che ne ha conseguentemente bloccato lo sviluppo.


Durante la colonizzazione, le piastre di petri prive di contaminanti possono essere conservate a temperatura ambiente, capovolte per evitare la formazione di condensa. Una volta pronte, si conservano in frigorifero dove possono durare un anno, o più, prima di seccarsi. In frigorifero però non devono essere messe capovolte, altrimenti ve le ritroverete piene d'acqua nel giro di qualche giorno. Per ovviare al problema, conservatele all'interno di scatole di plastica per alimenti, insieme a qualche sacchetto di essiccante, e poi riponete in frigorifero.

Alla prossima ;)

23 commenti:

  1. Caro Gianluca, le ho superate tutte le prove d'esame e mangio già funghi completamente autoprodotti, grazie a questo tuo blog, MA CON I PETRI E' UN DRAMMA.........
    1) condensa in tutti nei giorni a seguire (forse la comune pellicola usata per sigillare, non fa respirare?)
    2) si crea il primo micelio sul pezzo inoculato, ma non si diffonde sulla piastra???? sarà allergico all' agar???? (uso la tua ricetta)
    3) Tutto molto lento, anche la creazione di muffe e batteri impiegano 15gg e più!!!!

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  2. Quanta condensa si forma? Un po' è normale, se si limita a qualche gocciolina sulla superficie dell'agar non comporta nessun problema. Se invece si forma proprio uno strato d'acqua allora non va bene. Questo inconveniente si verifica principalmente quando il "brodo" viene versato nelle piastre quando è ancora troppo caldo. Lascia raffreddare la bottiglia per 30-40 minuti, finché non diventa maneggiabile a mani nude, e poi versi.
    Il fatto che si formi il micelio solo sul pezzetto di fungo mi sembra molto strano. Succede con alcune specie di fungo difficili da clonare, che non gradiscono il normale agar (ad esempio i Boleti). Forse c'è troppa acqua sulla superficie, che impedisce lo sviluppo?

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  3. la condensa si forma sul tappo!!!! e compare in crescendo nei primi due o tre gg. dopo la preparazione..... pensavo di sigillare troppo da non far respirare.... anzi il brodo mi sa un po' troppo secco, molto gommoso a gelatina!!

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  4. È normale che si formi sul tappo. Dove conservi i petri ed a che temperatura? Le dosi come le calcoli?

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  5. le dosi le ho prese dal questo blog, li conservo a temperatura ambiente (freddino 15 ° circa) in un magazzino.
    P.S. quello in corso è un tentativo con l'antibiotico che mi hai consigliato tu, ho messo 2 ml. in 600 ml. di acqua, operazioni ad aria aperta in presenza di fiamma (vorrei almeno vedere delle muffe).
    Le volte precedenti senza antibiotico, tutto contaminato..... la mia glove è scomoda e stretta, si appanna etc etc etc

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  6. Intendevo, come le hai misurate? Hai un bilancino di precisione o fai più "a occhio"?
    Di antibiotico mi sa che ne hai messo troppo, la dose è 1 ml per 500 ml di acqua. Se lavori all'aria aperta otterrai solo contaminazioni, ti consiglio di costruire una glove box più grande.

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  7. Ehi Gianluca ti ringrazio per il lavoro esplicativo e chiaro che stai mettendo a disposizione !

    Non fermarti, voglio saperne ancora di piu ! ;)

    Ciao e buon lavoro ! ^_^

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  8. Ciao, ti rigrazio prima di tutto per queste guide veramente utilissime. Volevo chiederti se vanno bene anche i contenitori per le urine al posto dei dischi petri, dato che nella mia zona non riesco proprio a trovali...

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  9. Ciao, grazie a te :)
    I contenitori per le urine possono andare bene per preparare provette (c.d. inclinazioni) riempite per metà di agar e poi sterilizzate, in cui conservare a lungo termine le colture. Per lavorare normalmente (moltiplicazione del micelio, isolamento di nuovi ceppi, ecc.) non sono assolutamente adatte. In alternativa ai petri potresti usare dei barattolini di vetro larghi e bassi, alla peggio puoi provare anche con i vasetti degli omogeneizzati. Comunque l'acquisto dei petri è necessario, su internet puoi trovarli facilmente, ad esempio su:

    http://www.omniatek.it/ecom/

    oppure puoi chiedere qui:

    http://funghi.forumup.it/viewtopic.php?t=1334&mforum=funghi

    per piccole quantità forse ti conviene comprare petri in vetro, che anche se più dispendiosi e scomodi sono riutilizzabili.

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    1. Buongiono a tutti, con quale codice CER vengono smaltiti i rifiuti speciali delle piatre petri con i residui di agar e muffe prodotte dai vegetali in coltura ? Grazie. Saluti. Roberto bob43@hotmail.it

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  10. ciao sono Salvatore ho trovato il tuo blog e sto sperimentanto... la prima cosa che mi è comparso dopo 2 giorni (anche se fa ancora freddino 16/17 gradi) sono delle piccole chiazzoline tipo bolle rotonde piccolissime che sembrerebbero micele, ma sono distanti dai pezzetti di funchi che ho posato. Ciò può essere causato dal fatto che quando li ho posati, per staccarli dal bisturini li ho strofinati un po su tutta la piastra? o sono qualcos'altro inoltre un giorno dopo ancora circa, (tre giorni dopo quindi) i pezzetti di fungho incominciano ad avere come dei peletti tipo muffa... va tutto bene?P.S non ho cappe o box ho lavorato sul tavolo della cucina sruzzando ost a volontà....

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  11. Salve Gianluca, ho trovato molto pratiche le guide riportate sul tuo sito. Ti volevo chiedere se magari conoscevi qualche sostituto della streptomicina o accorgimento per tenere a bada i batteri nelle piastre.

    Grazie in anticipo

    Giulio

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  12. Ciao, io ho usato diverse volte Gentamicina solfato in soluzione iniettabile con buoni risultati.
    Considera però che è sempre preferibile utilizzare agar SENZA antibiotici, poiché la funzione di questa fase è quella di isolare un ceppo privo di contaminanti. In presenza di un antibiotico spore di batteri e muffe potrebbero comunque rimanere latenti, salvo "esplodere" in un trasferimento successivo.
    Io ho usato l'antibiotico solo quando dovevo clonare funghi selvatici molto sporchi e difficili da pulire ;)

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  13. perfetto! Ti ringrazio!

    Giulio

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  14. Ciao, seguendo i tuoi consigli ho fatto crescere il micelio su piastra. Non ci sono contaminazioni ma la crescita è lentissima, dopo circa tre settimane il micelio non è visibile solo intorno ad i pezzetti di fungo e non ha ancora colonizzato tutta la piastra. E' normale, cosa devo fare?
    Grazie

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  15. Ciao,
    alcune specie sono molto lente, quindi potrebbe essere normale.
    Altro fattore che influenza molto la crescita su piastra è la temperatura, ci vogliono intorno ai 22° per una crescita ottimale.
    Altre volte la crescita è lenta nella fase iniziale, potresti provare ad effettuare un trasferimento su altra piastra sterile, prelevando un frammento di micelio (senza tessuto) e depositandolo su piastra pulita.

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    1. Ho messo su piastra il cardoncello. Proverò a trasferire su un'altra piastra. grazie mille del consiglio.

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  16. Ciao,

    mi chiedevo se le capsule petri una volta inoculate vadano tenute al buio?

    Grazie

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  17. Sì, in genere si conservano al buio

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  18. Ciao Gianluca, complimenti per il tuo blog! Volevo chiederti se sai dove si possono acquistare capsule petri con micelio di varie specie. Qualche anno fa ero riuscito a procurarmene alcune ma non ricordo più dove, forse in qualche forum. Mi sapresti aiutare?

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    1. Ti consiglio Shroomery.org/forums
      puoi trovare molti utenti con cui fare scambi di colture.

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  19. Buongiorno e buon natale.
    Complimenti per le importanti informazioni scientifiche che sono riportate in questo forum.
    Avrei bisogno di un metodo per sterilizzare le petri in pentola a pressione.
    Grazie Gianluca.

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  20. Ciao, sono un neofita e sto cercando di capire come funziona il tutto :)
    Ho comprato un disco di petri giá inoculato con Panellus Stipticus e si vede qualcosa, anche se non riesco a capire se si tratta di muffa o micelio.
    Volevo sapere quanto tempo devo tenere sigillato il disco? E dopo cosa devo fare per fare crescere il fungo? Aprire il disco e trasferirlo in un contenitore più grande?
    Ho provato a cercare informazioni, ma non riesco a trovare dettagli chiari su questi passaggi :(

    Grazie mille per l'aiuto!
    Antonio

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